分子克隆技術(shù)的發(fā)展源于限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)。該技術(shù)通常利用酶切位點(diǎn)將重組蛋白基因亞克隆至細(xì)菌表達(dá)載體，而這些位點(diǎn)會(huì)被保留在蛋白質(zhì)編碼序列中，進(jìn)而在其天然序列的前后翻譯產(chǎn)生額外的末端殘基。本研究聚焦于一個(gè)關(guān)鍵但常被忽視的因素：酶切位點(diǎn)所引入的額外末端殘基對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與動(dòng)力學(xué)的調(diào)控作用。從進(jìn)化視角看，蛋白質(zhì)由短鏈無(wú)序肽演化而來(lái)，逐步獲得功能復(fù)雜性與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

不同實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)出的折疊自由能的差異，默認(rèn)是不同實(shí)驗(yàn)手段所致，以冷休克蛋白（Cold Shock Protein, CSP）為例，不同實(shí)驗(yàn)方法所測(cè)得的折疊自由能存在顯著差異（約7.9–12.6 K_BT）。我們研究發(fā)現(xiàn)，這種差異源于蛋白質(zhì)兩端殘基的不同，或者是因?qū)嶒?yàn)需求所引入的其他額外結(jié)構(gòu)元件。

為明確末端外殘基的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)不同的酶切位點(diǎn)在CSP兩端引入不同的氨基酸殘基，創(chuàng)建了三種構(gòu)建體（LE-CSP-GS、KL-CSP-GS、KL-CSP-LE），利用單分子磁鑷技術(shù)，系統(tǒng)比較了CSP構(gòu)建體的折疊與去折疊動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示，LE-CSP-GS的去折疊速率常數(shù)比其他構(gòu)建體快一個(gè)數(shù)量級(jí)，而其折疊速率常數(shù)下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，導(dǎo)致其折疊自由能降低約5 K_BT。進(jìn)一步通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性差異主要源于殘基K6與E56之間形成的額外氫鍵。

這項(xiàng)結(jié)合單分子實(shí)驗(yàn)與模擬的工作表明，N端和C端的額外氨基酸殘基顯著影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，這一結(jié)論在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)上提供了一個(gè)新的策略。傳統(tǒng)策略是通過(guò)突變蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸殘基或重新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)來(lái)提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。而在端外引入殘基來(lái)提高穩(wěn)定性，在安全性和成本效益上更具有明顯優(yōu)勢(shì)。

該成果以“Effect of Additional Terminal Residues on the Folding and Unfolding Dynamics of Cold Shock Protein”為題，發(fā)表在A(yíng)dvanced Science上（一區(qū)，IF=15）。數(shù)理學(xué)院2022級(jí)碩士研究生胡丹為論文第一作者。溫州大學(xué)王艷偉副教授、廈門(mén)大學(xué)陳虎教授、國(guó)科溫州研究院郭子龍副研究員為論文共同通訊作者，溫州大學(xué)為第一通訊單位。相關(guān)工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金和浙江省自然科學(xué)基金的支持。

DOI: 10.1002/advs.202501369